Ученые исследовали роль кластера генов Zscan4

Удлинение теломер и геномную стабильность эмбриональных стволовых клеток регулирует белок Zscan4. Это доказали ученые из национального института по проблемам старения в Балтиморе, штат Мериленд, США.

Как известно было ранее, мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) происходят из внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты и характеризуются схожим с клетками ВКМ паттерном экспрессии генов. Одним из отличительных признаков мышиных ЭСК является исключительная стабильность генома. Отмечено, что частота мутаций в ЭСК более чем в 100 раз ниже, чем в мышиных эмбриональных фибробластах и других соматических клетках [1]. У мышиных ЭСК также существенно снижена частота хромосомных нарушений по сравнению с клетками, обладающими схожими характеристиками, такими как клетки эмбриональной карциномы и даже некоторыми линиями человеческих ЭСК [2]. Однако до сих пор не известен механизм, и не ясно, какие конкретные гены ответственны за поддержание такой геномной стабильности.

Другими отличительными чертами ЭСК являются плюрипотентность и способность к самообновлению. Оба этих свойства уже много лет находятся в фокусе интенсивных исследований [3]. Наконец, еще одной важнейшей особенностью ЭСК является игнорирование всех сигналов о дифференциации и способность к прохождению более чем 250 клеточных циклов, не подвергаясь трансформации [4].

В 2007 году был описан новый кластер генов Zscan4, который был охарактеризован как потенциальный регулятор стабильности генома на уровне двухклеточного эмбриона и ЭСК [5]. Название генов говорит о том, что в их структуру входят домены цинковый палец (zinc finger) и SCAN. В состав кластера Zscan4 входят шесть транскрибируемых генов-паралогов с высоким сходством первичной последовательности (Zscan4a-f), обобщенно называемых Zscan4. Стабильная экспрессия Zscan4 является маркером стадии позднего двухклеточного мышиного эмбриона и необходима для имплантации эмбриона в матку in vivo и образования бластоцисты в культуре тканей. Ген Zscan4d транскрибируется преимущественно на стадии двухклеточного эмбриона, в то время как белок Zscan4с обнаруживается в ЭСК и ассоциируется с процессами самообновления.

В оригинальной работе, опубликованной в журнале Nature, коллектив авторов под руководством Санг-Лим Ли (Sung-Lim Lee) и первооткрывателя Zscan4 Жеппино Фалько (Geppino Falco), (National Institute of Aging, Baltimor), исследовал роль кластера генов Zscan4 и показал, что их экспрессия необходима для долговременного культивирования ЭСК и поддержания целостности кариотипа, ассоциированной с регулируемой рекомбинацией теломер в нормальных недифференцированных ЭСК.

Основные выводы из представленного исследования:

Нокаут Zscan4 приводит к кризису культивирования;

Белок Zscan4 участвует в процессе удлинения теломер в ЭСК;

Zscan4 ингибирует спонтанный обмен сестринскими хроматидими (ОСХ);

Белок Zscan4 локализуется в области теломер.

Рис. 1 Модель, описывающая действие генов Zscan4 в ЭС клетках

В отдельно взятый период времени Zscan4 экспрессируется примерно в 5% ЭСК и характеризует неустойчивое состояние плюрипотентности, свойственное именно для ЭСК, в то время как другие гетерогенно экспрессирующиеся в ЭСК гены часто маркируют специфичные клеточные линии дифференцировки. Более того, практически все ЭСК при длительном культивировании экспрессируют Zscan4 как минимум один раз за девять пассажей. Авторы отмечают, что необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить сигналы, приводящие к активации Zscan4. Тем не менее, отмечается, что уникальный характер экспрессии Zscan4 подразумевает действие четкого регуляторного механизма. В пользу существования сложного регуляторного механизма свидетельствуют наблюдения, что нокдаун Zscan4 не влияет на клетки немедленно, но со временем влечет нарушения кариотипа, снижение темпа пролиферации и вызывает апоптоз к 7-8 пассажу. Таким образом, без скачкообразной активации Zscan4 ЭСК теряют свою важнейшую способность – неограниченную пролиферацию.

Исследователи отмечают, что, по всей видимости, нарушения кариотипа в ЭСК с подавленной экспрессией Zscan4 ассоциированы с укорочением теломер и одновременным увеличением спонтанного ОСХ, не связанного с теломерами. Zscan4 действует как активатор спонтанного теломерного обмена сестринскими хроматидами (Т-ОСХ) [6], что ведет к удлинению теломер у недифференцированных ЭСК. Таким образом, описана новая модель регуляции длины теломер у мышиных ЭСК с участием Zscan4, отличающаяся от ранее описанных механизмов. Основными характеристиками представленной новой модели являются:

1) Zscan4+ клетки претерпевают быстрое удлинение теломер, скорее всего за счет рекомбинации теломер или Т-ОСХ. По всей видимости, основной функцией белка Zscan4 является индукция экспрессии медиаторов мейотической гомологичной рекомбинации с образованием конфигурационного взаимодействия этих молекул с участками теломер;

2) исследователи продемонстрировали, что в недифференцированных ЭСК, экспрессирующих Zscan4, активна теломераза. Такая картина не наблюдается в клетках, в которых обычно происходит Т-ОСХ, таких как ЭСК, выживающие после нокаута теломеразы Terc -/- [7], и опухолевые клетки с невосстановленной или недостаточной активностью теломеразы [8]. Zscan4- опосредованное удлинение теломер не требует теломеразы, однако остается невыясненным, насколько Zscan4- опосредованное удлинение теломер способно компенсировать потерю теломер в ЭСК Terc -/-, которые прекращают пролиферировать после 450 удвоений [7];

3) большинство генов, ранее идентифицированных как регуляторы длины теломер, таких как ДНК метилтрансферазы DNMT1 и DNMT3 [9], а также ген синдрома Вернера WRN [10], являются ингибиторами Т-ОСХ. Подавление экспрессии этих генов ведет к увеличению частоты Т-ОСХ или/и длины теломер [11]. Исключение составляет ген Rtel1. В ЭСК Rtel1-/- происходит укорочение теломер после индукции дифференцировки [12]. Zscan4 демонстрирует схожий фенотип на недифференцированных ЭСК;

4) в противоположность обычному Т-ОСХ, который происходит в результате общей хромосомной нестабильности и сопровождается увеличенной частотой ОСХ не теломерных последовательностей, Zscan4-опосредованный Т-ОСХ не ассоциирован с увеличением общего ОСХ, и нормальный кариотип остается стабильным на фоне низкого уровня спонтанного ОСХ.

Рис. 2

Конфокальная микроскопия ЭС клеток на стадии митоза демонстрирует, что:

а) белок Zscan4 (красный, иммуноокрашивание) локализован на концах хромосом (синие, окраска DAPI) и ассоциирован с теломерами (зеленые, T-FISH с использованием пробы ДНК, конъюгированной с Alexa488);

б) маркер гомологичной рекомбинации SPO11 (красный, иммуноокрашивание) локализуется на теломерах через 3 суток после индукции Zscan4с.

В заключение можно отметить, что экспрессия Zscan4 варьирует среди различных типов плюрипотентных клеток, что может коррелировать с их различиями в стабильности генома [13]. Отбирая клетки, способные к активации Zscan4, вполне возможно продвинуться к получению культур клеток, пригодных для терапевтического использования. Более того, возможность контроля экспрессии Zscan4 может увеличить стабильность генома клеток других типов, таких как стволовые клетки или клетки опухолей.

По материалам: www.grc.nia.nih.gov, Zalzman M., Falco G., Sharova  L.V. et al. Zscan4 regulates telomere elongation and genomic stability in ES cells. Nature 2010; advance online publication: doi: 10.1038/nature08882, а также НИАЖ Клеточная трансплантология и тканевая инженерия — www.celltranspl.ru.

Источники:

1. Cervantes R. B., Stringer J. R., Shao C., Tischfield J. A., Stambrook P. J. Embryonic stem cells and somatic cells differ in mutation frequency and type. PNAS 2002; 99: 3586–90.

2. Brimble S.N., Zeng X., Weiler D.A. Karyotypic stability, genotyping, differentiation, feeder-free maintenance, and gene expression sampling in three human embryonic stem cell lines derived prior to August 9, 2001. Stem Cells Dev. 2004; 13: 585–97.

3. Niwa H. How is pluripotency determined and maintained? Development 2007; 134: 635–46.

4. Suda Y., Suzuki M., Ikawa Y., Aizawa S. Mouse embryonic stem cells exhibit indefinite proliferative potential. J. Cell. Physiol. 1987; 133: 197–201.

5. Falco G., Lee S.L., Stanghellini I. et al. Zscan4: a novel gene expressed exclusively in late 2-cell embryos and embryonic stem cells. Dev. Biol. 2007; 307: 539–50.

6. Liu L., Bailey S., Okuka M. et al. Telomere lengthening early in development. Nature Cell Biol. 2007; 9: 1436–41.

7. Wang Y., Erdmann N., Giannone R.  et al. An increase in telomere sister chromatid exchange in murine embryonic stem cells possessing critically shortened telomeres. PNAS 2005; 102: 10256–60.

8. Cesare A.J., Reddel R. R. Telomere uncapping and alternative lengthening of telomeres. Mech. Ageing Dev. 2008; 129: 99–108. [Abstract]

9. Gonzalo S., Jaco I., Fraga M. et al. DNA methyltransferases control telomere length and telomere recombination in mammalian cells. Nature Cell Biol. 2006; 8: 416–24.

10. Laud P.R., Multani A., Bailey S. et al. Elevated telomere-telomere recombination in WRN-deficient, telomere dysfunctional cells promotes escape from senescence and engagement of the ALT pathway. Genes Dev. 2005; 19: 2560–70.

11. De Boeck G., Forsyth R.G., Praet M., Hogendoorn P.C. Telomere-associated proteins: cross-talk between telomere maintenance and telomere-lengthening mechanisms. J. Pathol. 2009; 217: 327–44.

12. Ding H., Schertzer M., Wu X. et al. Regulation of murine telomere length by Rtel: an essential gene encoding a helicase-like protein. Cell 2004; 117: 873–86.

13. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663–76.